分析荣骨定痛膏对骨性关节炎模型大鼠造成的影响论文
骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是一种慢性进行性骨关节功能与结构退行性疾病，属于临床常见病，目前尚缺乏有效的根治措施，作为非手术疗法的中医药在治疗慢性退行性疾病过程中显示出独特的疗效而日益受到人们的重视。OA 属于中医“痹证”的范畴，多因肾气亏虚、关节失养，复受风寒湿邪，气血痹阻，经络不畅而发，治则为补益肝肾、活血通络、祛风散寒、胜湿止痛。在上述中医药理论指导下形成的荣骨定痛膏在临床上取得了较好的疗效。本研究通过复制OA大鼠模型，考察荣骨定痛膏对OA 大鼠膝关节结构与功能、关节腔内的炎性细胞以及对血清白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)与肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的影响，探讨荣骨定痛膏防治OA 的作用及机制，为临床用药提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 药物与试剂
荣骨定痛膏(靖远县中医院，批号：20140610，每毫升软膏剂含原生药1.5 g);盐酸氨基葡萄糖胶囊(浙江诚意药业有限公司，批号：20130603，规格：240 mg);木瓜蛋白酶(美国Sigma 公司，批号118K1461);IL-1β(批号：20140608)、IL-6(批号：20140608)与TNF-α(批号：20140501)试剂盒均购于北京华英生物技术研究所。
1.2 动物与分组
SPF 级，♂，SD 大鼠，体质量180~220 g，质量合格证号：62001000000033，由甘肃中医学院实验动物中心提供， 动物生产许可证号：SCXK(甘)2011-0001。SPF 级实验室，许可证号：SYXK(甘)2011-0001。48 只SD 大鼠，随机分为6组，即正常对照组，模型对照组，氨基葡萄糖组(90 mg·kg?1)，荣骨定痛膏高、中、低剂量组(120，60，30 mg·d?1)。
1.3 仪器
TGL-16G 高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂);N-5600PC 型METASH 可见分光光度计(上海元析仪器有限公司);HH-S 型恒温水浴锅(金坛市正基仪器有限公司);BS1103 电子天平(北京赛多里斯有限公司)。
1.4 造模与给药
各组大鼠膝关节周围及上下0.5 cm 处皮肤脱毛，参照相关实验方法[3-4]，在造模的第1，3，7天，将4%木瓜蛋白酶生理盐水溶液50 μL 注入大鼠膝关节腔内，正常对照组注射等量生理盐水。造模的同时给药，荣骨定痛膏高、中、低剂量组在大鼠膝关节及上下0.5 cm 处涂抹不同浓度(1.500，0.750，0.375 g·mL?1)的荣骨定痛膏40 μL(即60，30，15 mg)，氨基葡萄糖组灌胃0.9%氨基葡萄糖5 mL·kg?1(即45 mg·kg?1)，正常对照组与模型对照组膝关节涂抹蒸馏水，2 次·d?1，连续5 周。
1.5 指标检测
末次涂药2 h，麻醉大鼠后测量被动膝关节活动度;之后采血，测定IL-6、IL-1β 与TNF-α 的水平;取血后处死大鼠，抽提关节腔灌洗液，离心，取其沉淀混悬液制片，在光镜下分类计数炎性细胞并对其进行半定量分析;刮取关节面上的滑膜组织，测定关节滑膜厚度。
1.6 统计学处理
采用SPSS 11.5 统计软件进行分析，实验数据采用x ? s表示，组间比较采用单因素方差分析，半定量资料采用Ridit 分析，P<0.05 表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 荣骨定痛膏对OA 大鼠膝关节活动范围及关节滑膜厚度的影响与正常对照组比较，大鼠膝关节注射木瓜蛋白酶35 d 后，膝关节的活动范围明显缩窄，关节滑膜肿胀厚度明显增加(P<0.01);与模型对照组比较，经荣骨定痛膏防治后，膝关节的活动范围扩大，关节滑膜肿胀厚度明显减小(P<0.05 或0.01);与荣骨定痛膏低剂量组比较，荣骨定痛膏高剂量组的防治作用更强(P<0.05)，显示出一定的量效关系。
2.2 荣骨定痛膏对OA 大鼠关节液中炎性细胞的影响对关节灌洗沉淀混悬液中的炎性细胞数目分级结果显示，与正常对照组比较，注射木瓜蛋白酶后关节腔内的炎性细胞明显增加(P<0.01);与模型对照组比较，经荣骨定痛膏治疗后，关节腔内的炎性细胞数有所减少，其中荣骨定痛膏高剂量组差异有显著性(P<0.05)。
2.3 荣骨定痛膏对OA 大鼠模型血清细胞因子的影响与正常对照组比较，OA 模型大鼠血清IL-1β、IL-6 与TNF-α 均明显升高(P<0.01);与模型对照组比较，经荣骨定痛膏防治后，IL-1β、IL-6 与TNF-α均不同程度地下降(P<0.05 或0.01)。
3 讨论
OA 发病率随年龄的增长而升高，随着我国社会人口结构的迅速老龄化，该病发病率逐年增加。该病不仅是公共卫生问题，也成为社会问题，日益引起人们的重视。OA 的发病机制非常复杂，但其基本病理变化为关节软骨的退行性改变与关节的增生性改变(特别是软骨周围及滑膜处)。目前临床上尚缺乏有效的根治措施，手术治疗又缺乏确切有效的临床治疗方案，作为非手术疗法的中医药治疗日益受到人们的`重视。
在OA 的发病过程中，炎症细胞及促炎性细胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α 等是参与OA 炎症反应的重要物质基础，对滑膜炎症的发展与软骨基质的破坏具有重要作用，也是OA 治疗的潜在靶点。IL-1 是最早出现也是最重要的OA 促炎因子，主要由单核巨噬细胞分泌，亦可由软骨细胞、滑膜细胞产生。IL-1 有IL-1α 与IL-1β 2 种亚型，其中IL-1β 是IL-1 的主要成分，成熟的IL-1β 是由IL-1 转换酶裂解IL-1β 前体而来，是一种强有力的致痛炎症因子，在急慢性炎症中引发全身性症状如发热，在局部则引起组织炎症和破坏性病变。在正常关节中IL-1 含量极少，且主要是IL-1β，在OA 中，IL-1、特别是IL-1β 的含量异常升高，影响软骨细胞的结构和功能，促进其凋亡，打破软骨基质合成与代谢间的平衡，使滑膜出现炎性病变，最终导致关节软骨的破坏。在关节结构中，软骨细胞与滑膜细胞对于保持关节功能和结构发挥着极其重要的作用，IL-1 参与关节软骨与滑膜破坏的起始和进展，IL-1 杀伤线粒体呼吸链，导致线粒体功能紊乱，软骨细胞与滑膜细胞的能量供应减少，使其活性下降，关节的弹性与润滑功能降低。OA 发病过程中，关节的功能和疼痛与关节滑膜细胞分泌过多的IL-6 并释放入血有关。TNF 按其结构不同分为TNF-α 和TNF-β，其中由活化的巨噬细胞、单核细胞和T 细胞产生的为TNF-α。研究发现TNF-α 是参与OA 炎症反应的重要因素，TNF-α 可刺激滑膜细胞产生前列腺素-E2，增加软骨下骨的吸收，引起关节软骨Ⅱ型胶原的破坏，在关节滑膜炎性病变及软骨基质的降解过程中起重要作用。
中医理论认为，OA 多因肾气亏虚，关节失养，局部劳损癖阻，复受风寒湿邪，经络不畅，气血痹阻，关节寒凝、痰阻，不通则痛，故治疗应补益肝肾、活血通络、祛风散寒、胜湿止痛。在此基础上拟定的荣骨定痛膏由山茱萸、杜仲、牛膝、当归、秦艽、独活、川乌等四十余味中药组成，在靖远县中医院临床使用取得了较好的疗效。本次动物实验结果显示，荣骨定痛膏可明显扩大病变关节的活动范围，减小滑膜肿胀厚度，从而改善OA 关节的结构与功能。本次实验发现荣骨定痛膏在防治OA 的过程中，可使关节腔内的炎性细胞减少，不同程度地降低IL-1β、IL-6 与TNF-α 的水平，减轻由炎性细胞与上述促炎因子引起的局部与全身反应。结果提示缓解OA 关节炎症、抑制促炎因子IL-1β、IL-6 与TNF-α 的异常升高可能是荣骨定痛膏对OA 起治疗作用的机制之一。
由于荣骨定痛膏有多种中药制成，其膏液有一定的成膜性，在本实验中当给药体积在50 μL以下时，在涂抹药膏后用热风吹干，可在大鼠关节形成附着性很好的极薄药膜，经12 h 观察药膜无脱落和舔舐现象。根据预实验结果确定每天给药2 次，既可防止一次给药造成药膜太厚引起脱落和大鼠不适舔舐，又可保证每日给药剂量，提高了实验结果的可靠性。
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