详谈激光针灸对模型大鼠滑膜组织病理改变的影响论文
类风湿性关节炎( rheumatoid arthritis，RA) 是一种系统性自身免疫性疾病，其特点是在多个关节滑膜出现慢性炎症、软骨破坏、骨侵蚀，出现关节肿胀、僵硬、畸形并伴有严重疼痛。不受控制的RA 可引起肺癌和心血管系统等多种组织的全身炎症，导致并发症和死亡率增加。虽然RA 的病因和发病机制还未完全理解，但促炎细胞因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平升高与疾病的进展和严重程度紧密联系。多项研究显示，激光针灸对RA 的治疗具有疗效好、不良反应少等优点，但对其治疗机制的研究仍然不甚明确。本研究报道了通过II 型胶原诱导的关节炎( collagen-induced arthritis，CIA) 大鼠模型，探讨激光针灸对其保护作用，为临床治疗提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验动物4 周龄健康SD 雄性大鼠40只，清洁级，体质量( 125 ± 20) g，由安徽医科大学动物实验中心提供。
1. 1. 2 试剂与器材连续半导体激光器( 波长635 nm) 由中国医学科学院生物医学工程研究所激光医学实验室研制。Ⅱ型胶原蛋白购自Chondrex公司，弗氏完全佐剂购自Sigma 公司，扶他林购自北京诺华制药有限公司，酶标仪购自MR 公司。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 造模与分组将所有动物称重后随机编号为1-40 号，1-10 号为正常对照组，不做任何处理; 将其余的90 只大鼠采用II 型胶原蛋白进行CIA造模。首先将用0. 1M 的冰醋酸溶解至浓度为2 g / L 的溶液，于4℃ 过夜，加入等体积的弗氏完全佐剂，将两者在冰浴中混匀乳化制成乳剂，且终浓度为1g /L。每只大鼠注射1ml 该溶液，在背部皮下、尾根部和右后足跖部多点注射，1 周后再次注射0. 5ml加强免疫1 次，建造II 型胶原蛋白诱导的大鼠实验性关节炎( CIA) 模型。模型建造后2 周，将造模成功的大鼠按随机数字表法分为为模型组( CIA 模型组) 、药物治疗对照组( 即大鼠每天用0. 8 mg /100g 剂量的扶他林乳液灌胃) 、激光针灸治疗组( 即每只大鼠每天采用激光照射针灸治疗) 3 组。模型组、正常对照组和针灸治疗组每天注射生理盐水。
1. 2. 2 取穴和针灸方法①取穴: 参照“十一五”国家级规划教材《实验针灸学》的定位方法，取大鼠的足三里穴、肾俞穴，肾俞穴在第2 腰椎下两旁、左右各1 穴，足三里在膝关节后外侧、腓骨小头下0. 5 cm 处。在实验过程中，采用交替治疗单侧穴位、左右交叉选取，即在第1 天选择治疗左侧足三里穴和肾俞穴，第2 天则用右侧足三里穴和肾俞穴，第3 天再用左侧进行交替治疗。各组在激光针灸治疗前对穴位区局部皮肤均进行剃毛、清洁处理。②激光针灸: 在建造CIA 模型致炎后第3 周，将针灸治疗组实验动物以同样固定架固定，对足三里穴、肾俞穴进行激光照射。激光输出功率100 mW，功率密度1. 42 W/cm2，光斑直径均为0. 3 cm，照射时间10min，每日1 次，共治疗15 次。
1. 2. 3 采集标本和指标检测1) 大鼠关节评分和足肿胀观察: 在造模及药物或针灸治疗前后仔细观察大鼠神志活动及体毛色泽的改变，在给药或激光针灸前1 d，给药后或激光针灸后的7 d、14 d，用足趾容积测量仪测量足趾的体积，测量3 次取平均值，根据四肢的病变程度进行累计积分。2) 采用关节炎指数( Arthritis Index，AI) 对关节红肿程度进行评定: 关节无红肿的为0 分; 个别足趾红肿发胀为1 分; 大部分足趾及足底红肿发胀为2 分; 踝关节以下全部肿胀为3 分; 累计踝关节以上肿胀及不能负重为4 分。AI 为四肢关节评分之和。3) 提取滑膜组织与评分: 实验结束后处死所有实验动物，将大鼠浸泡在100 g /L 的强力消毒水中泡10 min，在超净工作台上固定后剪取左踝关节，切开皮肤后剥离滑膜组织，并用刀片完整切下。用甲醛溶液固定后石蜡包埋、切片，用苏木精-伊红染色液( HE) 染色后在显微镜下观察滑膜组织的病理学改变。参照文献，根据以下标准对滑膜组织病理变化进行评分。①滑膜细胞增生: 无明显( 0) 为0 分; 单层密集、肿胀( + ) 为1 分; 增生成2 层( + + ) 为2 分; 增生成3层及以上( + + + ) 为3 分; ②炎性细胞浸润: 未见或偶见( 0) 为0 分; 稀疏散在少量( + ) 为1 分，较密集中等量( + + ) 为2 分，密集大量( + + + ) 为3分; ③纤维组织增生: 无增生( 0) 为0 分，少量增生( + ) 为1 分，中等量增生( + + ) 为2 分，大量增生( + + + ) 为3 分; ④巨噬细胞增生: 未见( 0) 为0分，稀疏散在少量( + ) 为1 分，中等量( + + ) 为2分，大量( + + + ) 为3 分。
1. 3 统计学方法
采用SPSS 19. 0 统计软件进行分析处理，计量资料以均数± 标准差( 珋x ± s) 表示，2 组样本间均数比较采用t 检验，多组样本间比较采用单因素方差分析，P < 0. 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2. 1 激光针灸对大鼠身体及关节肿胀的作用
模型组与空白对照组比较，大鼠的活动有所减少，精神状况萎靡，后肢关节部位在造模后第8 天时出现红肿且日益加重。采用药物治疗和针灸治疗后，大鼠后肢的肿胀程度减轻，精神状态良好，饮食正常。与模型组比较，给药或激光针灸后14 d，左后肢的足容积明显减小，差异有统计学意义，但均大于空白对照组和给药前的足容积。经过药物和激光针灸后，与模型组比较，关节炎指数AI 明显降低，且随着治疗时间的延长，肿胀程度逐渐减轻。
2. 2 激光针灸对滑膜组织的影响
组织学检查结果显示，与正常组大鼠比较，CIA大鼠的滑膜关节中出现大量细胞浸润、滑膜增生、关节狭窄，形成严重的血管。但在药物治疗组和激光针灸组，这些病理变化明显减少 。与空白对照组比较，模型组大鼠的滑膜增生、炎性细胞浸润、巨噬细胞增生及纤维组织增生评分和总评分均有统计学意义，显示造模成功，模型组大鼠的踝关节滑膜组织的病理学改变明显。药物治疗和激光针灸组与模型组比较，滑膜增生、炎性细胞浸润、巨噬细胞增生及纤维组织增生评分与总评分出现不同程度的下降，差异有统计学意义。
3 讨论
风湿关节炎是一种复杂的难治性自身免疫性疾病，特点是关节疼痛、多发性关节炎、关节破坏，它是由不同致病因素造成的，包括全身和局部炎症、细胞和体液免疫反应、广泛的血管生成、基质金属蛋白酶和破骨细胞破坏骨骼和软骨，但其具体的发病机制尚不明确。表4 显示，激光针灸可以抑制滑膜细胞和纤维组织增生，减少炎性细胞浸润，与对照药物扶他林比较，疗效相当，差异无统计学意义。且激光治疗可以缓解足肿胀，降低大鼠四肢的AI 值，但激光针灸治疗的作用机制尚待进一步研究，可能是与加快血液循环有关。
对该病机制的研究，模型的选择是至关重要的。与经典的佐剂诱导关节炎( agjuvant-inducedarthritis，AIA) 比较，CIA 模型的临床表现、发病机制和病例特点以及免疫学指标与人的RA 比较，具有更多的相似性和可比性，是目前国内比较认可的用于研究RA 的动物实验模型。在本研究中，采用CIA 造模2 周后，大鼠的踝关节出现滑膜增生、纤维组织和巨噬细胞增生、炎性细胞浸润，与正常组大鼠比较差异有统计学意义。这些病理学表现表明，模型组的.病理学改变与人的RA 接近，说明该模型对于后续的激光针灸治疗结果具有更好的可靠性。
在该病的发病过程中，4 种病理学改变反映了RA 的发病程度，滑膜细胞增生是RA 发病的早期反应，随着病程的延长，会出现滑膜组织增厚、关节黏连等病理学改变，该反应是该病发病过程中的最直接反应。炎性细胞的浸润反映了免疫反应的激烈程度。该研究结果显示，药物组和激光针灸组均有一定程度的炎性细胞浸润，但与模型组比较有所下降，差异有统计学意义，说明药物或者激光治疗具有一定程度减轻炎性反应的作用。巨噬细胞分为A 型和B 型，是滑膜衬里层的2 种主要细胞，主要来源于血液中单核细胞的浸润转移。纤维组织增生则反映了炎症破坏后纤维组织转移后的修复情况，纤维组织增生越严重，说明关节的软骨破坏越大。我们的研究结果显示，药物治疗和激光治疗均有一定程度抑制纤维组织增生的作用，且随着治疗时间的延长效果更明显。
总之，激光针灸治疗CIA 大鼠，对大鼠踝关节的滑膜组织增生和纤维组织增生具有一定的抑制作用，其作用效果和药物治疗效果相当，但其治疗作用机制还有待进一步的研究。该治疗手段也许可以作为不愿服药或者药物治疗效果差患者的主要或辅助治疗手段。
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