组合添加代谢调控剂对肌苷发酵及其代谢流分布的影响分析论文
1引言
肌苷又称次黄嘌呤核苷，它在食品和医药等领域有着广泛的用途.肌苷是食品工业中肌苷酸的原料，同时也是各种调味食品的营养助鲜剂;在医药上，肌苷能预防及解除由血防药物引起的对心脏或肝脏的副作用，是治疗冠心病、肝炎、白血球减少症等的良效药物。
通过研究细胞代谢流的动态变化，对发酵过程进行优化是目前研究的热点。而根据细胞生长和产物合成的代谢调控机理，添加代谢调控剂对代谢过程进行调控，成为增加产物产量的有效方式。发现添加柠檬酸可以减小糖酵解途径(EMP)的代谢通量，同时增大磷酸戊糖途径(HMP)和三梭酸循环(TCA)的代谢通量，从而造成核糖合成代谢流的增加，使糖产量得到显著提高。刘新星等在基础培养基中添加0.2 g的柠檬酸钠，使糖酵解途径中磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活力降低，从而减弱了糖酵解途径的通量，肌苷产量提高了18%。陈双喜等在肌苷摇瓶发酵过程中添加10 g，的葡萄糖酸钙，能够诱导葡萄糖酸激酶的生成，增大磷酸戊糖途径的代谢通量，肌苷-产率由10.76 g提高到18.36 g。
对于肌苷生产来说，糖酵解途径代谢流的减弱会导致代谢流在EMP途径、HMP途径和TCA循环之间的重新分配，使更多的碳源转向HMP途径，从而为肌苷的合成提供更多的前体。因此，只要添加对代谢途径关键酶具有特定调控作用的代谢调控剂，就可以有效地增加肌苷的发酵产量。不过，在发酵过程单一添加一种代谢调控剂，仅针对肌苷，生物合成过程中的一种或少数几种关键酶进行调节，其他的限制肌苷，合成的调控节点并没有得到改善。而如果在发酵过程中组合添加代谢调控剂，使多个关键节点同时得到有效调控，有可能使肌苷产量得到进一步的提高，这方而的研究还未见报道。因此，木实验根据肌苷-的合成机理，选择对肌苷，生物合成过程具有特定调控作用的代谢调控剂，在考察单一添加代谢调控剂对肌苷生物合成影响的基础上，组合添加这些代谢调控剂，对肌苷生物合成过程的多个关键代谢调控节点进行调控，增大流向肌苷合成的代谢流，使肌苷产量得到显著提升。进而利用代谢通量分析的方法，对组合添加代谢调控剂提高肌苷产量的代谢调控机理进行深入分析。
2结果与讨论
2.1单一代谢调控剂的选择及其对肌苷发酵的影响
相关研究表明，在发酵过程添加柠檬酸钠或葡萄糖酸钙，可以对6-磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶或葡萄糖酸激酶等代谢途径中的关键酶进行调节，抑制EMP途径并增大HMP途径的代谢通量，引起代谢流朝向有利于肌苷-合成的方向迁移。在初始培养基中分别添加不同浓度的柠檬酸钠或葡萄糖酸钙，检测发酵肌苷产量和生物量。
适量添加柠檬酸钠可以提高枯草芽抱杆菌的肌苷产量。其中，在培养基中添加3 g柠檬酸钠，肌苷产量比对照组增加13.9%。柠檬酸和葡萄糖的联合代谢可增加C a2的吸收，对丙酮酸激酶产生强烈抑制，造成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的累积，PEP是磷酸果糖激酶的强烈抑制剂，丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶是EMP途径的关键酶，造成EMP途径通量减弱，导致更多的碳源进入HMP途径。
在培养基中添加葡萄糖酸钙，肌苷发酵产量比对照组增加27.8%。在枯草杆菌中，少量葡萄糖经葡萄糖脱氢酶生产葡萄糖酸，然后在葡萄糖酸激酶的作用下生成6-磷酸-葡萄糖酸，进入HMP途径，加入葡萄糖酸钙可以大幅度提高葡萄糖酸激酶的比活，增大HMP途径的通量，一方而促进菌体合成，另一方而为肌苷合成提供较多的前体物质，提高肌苷的产率。
根据类似的调节机理，选择烯醇化酶抑制剂、酸酶激活剂、和肌苷合成的前体次黄嘌呤核苷等三种代谢调控剂，分别考察其不同的的添加量对肌苷合成的影响。
适量的添加NaF对肌苷产量具有显著的提高作用，当添加2 mg时，肌苷产量比对照组提高了23.9% 。因此，添加适量的NaF可以减弱糖酵解途径通量，使更多的糖进入HMP途径为肌苷的生物合成提供更多的前体，从而提高了肌苷产量。
适量添加氯化钙对枯草芽抱杆菌的生长以及肌苷-的积累均有一定的促进作用。其中，当添加5 mg，的CaClz时，生物量可以达到最大值;而当加入10 mg，的C aC 1z时，肌苷产量达到最大值，比对照组的肌苷-产量高出了23.1%。这主要是因为CaCI的添加可以提高。酸酶的活力，而酸酶是肌苷合成途径中的关键酶，酸酶活力的增加有助于肌苷的积累，因此CaCI的适量添加有助于肌苷产量的`提高。
添加适量的次黄嘌呤核苷对枯草芽抱杆菌的生长没有明显的促进作用，但对肌苷产量的积累却有显著地提高作用，尤其当添加0.15%次黄嘌呤核苷时，肌苷产量比对照组提高了89.9%，这与次黄嘌呤核苷，合成途径的前体物质有关，加入的次黄嘌呤核苷为枯草芽抱杆菌提供了完整的吟环，从而使得枯草芽抱杆菌便于通过补救途径大量合成肌苷。
2.2组合添加代谢调控剂对肌苷发酵的影响
针对肌苷，合成过程的代谢调控节点，在发酵过程分别添加NaF、次黄嘌呤核苷、葡萄糖酸钙、C aC 1z和柠檬酸钠等五种代谢调控剂，使代谢流朝向有利于肌苷-合成的方向，可以有效地提高发酵过程的肌苷，产量。不过，在发酵过程单一添加一种代谢调控剂，仅针对肌苷，生物合成过程中的少数节点进行调控，其他的限制肌苷，合成的关键节点并没有得到改善。因此，在发酵过程中组合添加这五种代谢调控剂，同时对肌苷，合成的多个关键节点进行调控，以使肌苷-合成的代谢流得到进一步的增大，促进肌苷产量的进一步提高。
2.3组合添加代谢调控剂对肌苷发酵影响的代谢通量分析
在进行代谢通量分析时，主要针对枯草芽抱杆菌发酵中后期这段时间进行代谢通量分析，因为该阶段肌苷，的积累速率达到最大，同时细胞的生长处于稳定期，此时关于细胞代谢过程的拟稳态假设更接近成立。
以上这些结果表明，减弱EMP途径的代谢流量以及增大HMP途径的代谢流量，可以促进肌苷合成。
单一添加代谢调控剂，仅针对一个或少数几个节点进行调控，葡萄糖代谢流在各分支途径中的分配远未达到最佳，肌苷产量提高有限。相比之下，在发酵过程组合添加不同的代谢调控剂，可以同时对多个代谢调控节点进行调控，使得葡萄糖代谢流由EMP途径向HMP途径发生较大程度的迁移，实现对葡萄糖主体代谢流分布的调整，促使肌苷的产率得到显著的提高。
3结论
根据枯草芽抱杆菌生物合成肌苷的代谢调控机理，选择五种有利于肌苷积累的代谢调控剂: 次黄嘌呤核苷、葡萄糖酸钙、柠檬酸钠。在培养基中组合添加这些代谢调控剂时，肌苷产量得到进一步提高，当组合添加2 mg，0.15%次黄嘌呤核苷、15 g葡萄糖酸钙和10mgCaClz时，肌苷-的产量达到了14.01 g，相比不添加代谢调控剂的空白对照组肌苷产量增加了3.39倍。对代谢网路各分支途径的代谢通量变化进行测定，从代谢调控的角度确证了组合添加代谢调控剂，针对多个代谢调控节点进行调控，可以实现葡萄糖代谢流中各分支途径的合理分配，促使发酵过程的葡萄糖代谢流由EMP途径向HMP途径发生迁移，肌苷产量得到显著提升。
【组合添加代谢调控剂对肌苷发酵及其代谢流分布的影响分析论文】相关文章：
探析医疗社会保险对居民消费影响分析论文08-08
PM2.5对运动的影响论文开题报告01-10
家庭教育对幼儿的影响论文开题报告10-24
小议病案管理对医疗保险的影响论文08-10
关于论文构思提纲运用对写作成绩的影响07-01
广西生育保险政策对基金支出的影响研究论文08-09
有关PM2.5对运动的影响的论文开题报告10-06
构思阶段的提纲运用对写作成绩的影响论文07-03
信息素养对大学生创业能力的影响的论文07-19