大黄素甲醚对抑郁大鼠海马ERK、cAMP、CaMK 的影响论文
目前抗抑郁药在治疗抑郁症时都有几个共性，如起效迟缓、需长期服药，只有约60%～70%的患者有效等。大黄素甲醚有抗抑郁作用，与抑郁相关的信号通路的调节是抗抑郁药长期作用的一个中心环节，本研究在前期动物实验基础上采用慢性轻度不可预见应激(CUMS)大鼠抑郁模型，以海马细胞外信号调节激酶(ERK)，环磷腺苷(cAMP)，钙离子依赖的蛋白激酶(CaMK)信号通路为切入点，探讨大黄素甲醚的抗抑郁作用机制。
1材料和方法
1.1试验
药物大黄素甲醚(标准品)由成都普思生物科技有限公司提供，纯度:95%，百优解，礼来苏州制药有限公司，批号J20120001，临用前用蒸馏水配制为混悬液。
1.2动物雄性SD大鼠，体重180g～220g，购于简阳达硕动物科技有限公司，合格证号:SCXK(川)2014-189。
1.3试剂
ERK试剂盒，货号:20140630LC，cAMP试剂盒，货号:20140622SA，CaMK试剂盒，货号:20140630LK，均由Abcam公司生产，北京永辉生物科技有限公司进口分装。
1.4仪器
酶标仪:型号:MultlskanMk3，赛默飞世尔仪器有限公司生产，大鼠开场实验箱100cm×100cm木箱(自制)，底部等分为25个20cm×20cm小格。转轮式切片机(徕卡-2016，德国);数码三目摄像显微镜(BA400Digital，麦克奥迪实业集团有限公司)等;图像分析软件MoticImagesAdvanced。
1.5方法参照文献
稍作改进，将60只SPF雄性大鼠，随机分成2组:空白组10只，模型组50只。模型组的大鼠造模2周后，按体重和开场实验结果随机分为模型组、百优解组、大黄素甲醚高中低剂量组。刺激因子包括14种:水平震荡(30次/min，1min/d)、电刺激(0.1mA，1min/次×10次)、噪音(10dB，1min/次×10次)、通宵照明(日光灯24h)、冰水游泳(4℃，5min)、禁食(24h)、鼠笼倾斜(45°12h)、热刺激(45℃烘箱，5min)、潮湿垫料(将200ml水加到有垫料的笼底)、禁水(24h)、禁食禁水(24h)、异物放置(100g沙子24h)、明暗循环(4次，30min/次)、异味刺激(0.6%冰醋酸24h)。每日安排1种刺激，使动物不能预料刺激的发生，共造模6周。造模第3周开始给药至第6周结束，共给药4周，空白组及模型组给予等容积蒸馏水。
1.5.1开场实验将大鼠放入自制大鼠开场实验箱的中心位置，适应2min后，观察随后4min内大鼠的爬行格子数、站立次数。彻底清洁实验箱之后再进行下一只大鼠的观察。为避免每周进行而动物产生适应性，开场实验分别在大鼠分组前、造模2周及6周后进行，共3次。
1.5.2糖水消耗实验造模前一周对大鼠进行2次1%糖水偏好训练，然后在造模前1天和造模后每周固定时间测定1次，共计7次。糖水偏好训练和测试均于大鼠禁食禁水24h后进行，时间为下午14:00～15:00。以大鼠的糖水偏爱百分比(糖水消耗量/总液体消耗量×100%)作为评价指标。
1.5.3大鼠海马ERK、cAMP、CaMK的蛋白含量测定取海马，-80℃冰箱保存，第二天测指标。采用酶联免疫吸附法测定海马ERK、cAMP、CaMK蛋白含量，本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠ERK、cAMP、CaMK水平。用纯化的大鼠ERK、cAMP、CaMK抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加ERK、cAMP、CaMK与HRP标记的ERK、cAMP、CaMK抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的ERK、cAMP、CaMK呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中大鼠ERK、cAMP、CaMK浓度。
1.5.4大鼠脑组织病理形态学的观察参照大鼠脑组织定位图谱取大鼠脑组织，10%中性甲醛固定，经过不同浓度乙醇梯度脱水、二甲苯透明，石蜡包埋切片，苏木精-伊红染色，常规光镜观察，显微镜照相。
2结果
2.1大黄素甲醚对CUMS模型大鼠爬行格子数和站立次数的影响__结果表明，在CUMS造模程序连续实施的6周，与空白组比较，模型组的大鼠在开场实验中的.爬行格子数和站立次数表现出低下，提示该模型的有效性和持续性。与模型组比较，大黄素甲醚能对抗该程序对动物运动能力和探究能力的抑制作用。
2.2大黄素甲醚对CUMS模型大鼠糖水消耗量的影响结果表明，CUMS程序实施后，模型组与空白组比较，大鼠糖水消耗量显著减少;CUMS程序实施6周，模型组的大鼠糖水消耗量仍然显著低于空白组。提示CUMS程序的应用能引起动物的快感缺乏，该模型的有效性和持续性。大黄素甲醚给药1周(造模第3周)对模型组的大鼠糖水消耗量无显著影响;连续给药2周(造模第4周)，大黄素甲醚能提高模型大鼠的糖水消耗量;连续给药4周(造模第6周)，大黄素甲醚能提高模型大鼠的糖水消耗量，无统计学意义。
2.3大黄素甲醚对CUMS模型大鼠海马细胞外信号调节激酶，钙离子依赖的蛋白激酶，环磷腺苷蛋白含量的影响与空白组比较，模型组海马海马ERK、cAMP的蛋白含量减少，CaMK的蛋白含量增加，与模型组比较，大黄素甲醚能增加海马ERK、cAMP的蛋白含量，减少CaMK的蛋白含量。
2.4大黄素甲醚对CUMS模型大鼠脑组织病理形态的影响与空白组比较，模型组灰质区细胞层次欠清楚，神经细胞(锥体细胞)似减少，排列较乱、密集，部分退变的神经元为紫蓝色小体(密集嗜碱性深染不规则梭形结构)，细胞浆、核不清，胶质细胞增生;白质区灶性致密红染(可能为神经纤维变性所致)，可见退行性病变。与模型组比较，大黄素甲醚脑灰质、白质区组织结构正常，灰质区细胞层次可见细胞数量基本正常，退变的神经元嗜碱性深染不规则梭形结构可见，数量较模型组少，皮质表层水肿，组织裂开，细胞间可见棕色细颗粒物，胶质细胞数量较多，病变总体较轻。
3讨论
研究表明，与抑郁相关的信号通路及转录因子的调节是抗抑郁药长期作用的一个中心环节。而环磷酸腺苷反应原件结合蛋白(cAMPresponseelementbindingprotein，CREB)是这些相关信号通路中的一个交汇点，对胞内的生化过程有着重要的影响。新的研究提示，CREB相关信号通路的激活，可能在抑郁症发病及抗抑郁药作用机制中起重要作用。多种不同的信号转导通路可以CREB磷酸化，CREB可被cAMP系统中的PKA磷酸化，被CaMK和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路中的核糖体S6激酶磷酸化。这3种CREB的磷酸化方式是目前研究认为与抑郁症和抗抑郁药作用相关的3条通路，而CREB正是上述通路的交汇点。
ERK为MAPK信号转导介质家族的一员，主要调节细胞的生长和分化，ERK与记忆和突触可塑性关系密切，ERK通过磷酸化CREB而调节CREB的活性，参与了记忆和长时程增强(LTP)的调控。脑内ERK1/2活性和表达的改变引起抑郁症的发生。结果显示，慢性应激引起大鼠海马ERK蛋白含量降低，ERK活性降低削弱其对CREB的调节能力，引起CREB磷酸化水平降低，进而损害了长时记忆和LTP的形成。但具体机制需要更详尽的研究加以阐明。
CaMK信号通路在抑郁症发病及抗抑郁治疗途径中具有重要作用。另有研究证实，CaMK在钙信号转导通路中起着轴心的作用，是CaMK通路上关键因子，其蛋白表达变化反映了CaMK通路的活性，CREB磷酸化→调节基因转录→生物效应。可能通过抑制CaMK信号转导通路活性而发挥其抗抑郁效应。cAMP通路，在情绪调节中起重要作用，是研究得最早、最为深入的抗抑郁药信号转导通路，是细胞内普遍存在的一种信号转导通路，许多胞内的生化反应机制都是其启动或参与的。多数抗抑郁药可以引起脑内5-羟色胺(5-HT)和去甲肾上腺素(NE)浓度增加，5-HT和NE与G蛋白偶联受体结合，激活cAMP通路。
本研究采用采用酶联免疫吸附法测定海马ERK、cAMP、CaMK蛋白含量，结果显示，CUMS造模程序可使大鼠海马ERK、cAMP的蛋白含量减少，CaMK的蛋白含量增加，进一步证实了信号转导通路的变化在抑郁症发病机制中的作用，大黄素甲醚能增加CUMS大鼠海马ERK、cAMP的蛋白含量，减少CaMK的蛋白含量。综上所述，大黄素甲醚具有抗抑郁作用，其机制通过影响海马ERK、cAMP、CaMK的蛋白含量，改善受损伤的脑组织，可能通过调节与抑郁症相关的3条通路，使CREB磷酸化，关于大黄素甲醚对这3条通路的交汇点CREB有无作用还需做进一步的研究。
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