分析D3形态学低评分胚胎囊胚形成的影响因素论文
随着序贯培养系统的不断完善，形态学低评分胚胎的利用价值日益受到关注。已有报道形态学低评分胚胎经体外继续培养仍有一部分能发育成囊胚，且移植这些由取卵后第3天(D3)形态学低评分胚胎培养而来的囊胚最终获得妊娠，并且可以利用这类形态学低评分胚胎建立人类胚胎干细胞(human embryonic stem cell)系用于研究。已有很多文献报道了胚胎形态与低评分胚胎囊胚形成的关系，但对形态学低评分胚胎囊胚形成的相关临床因素却很少涉及，本研究通过对影响低评分胚胎囊胚形成的相关临床因素及胚胎因素进行分析，为如何挑选低评分胚胎继续培养以及提高囊胚形成率及质量提供理论支持和数据参考。
1 对象与方法
1.1 研究对象
收集2012年4月—2012年12月在本生殖中心行常规体外受精/胞浆内单精子注射-胚胎移植(IVF/ICSIET)治疗且满足以下纳入标准的所有患者：①第1个IVF/ICSI-ET治疗周期。②采用黄体中期降调的长方案。③新鲜周期移植2个或3个优质胚胎后还有剩余的低评分胚胎行囊胚培养，移植优质胚胎后若还有剩余的优质胚胎则进行玻璃化快速冷冻保存。经患者知情同意后将低评分胚胎移入囊胚培养液中继续培养观察，记录囊胚发育情况，有囊胚形成者根据囊胚质量选择冻存或丢弃。422个周期共有1 745个低评分胚胎进行了继续囊胚培养。
1.2 实验方法
1.2.1 胚胎培养及评估
按Peter卵裂期胚胎评分系统评估D3胚胎质量[4]。Ⅰ级：卵裂球大小一致，胞质均匀，细胞碎片<10%;Ⅱ级：卵裂球大小一致，胞质均匀，10%≤细胞碎片≤20%;Ⅲ级：卵裂球大小不一致，胞质不均匀，细胞碎片<10%;Ⅳ级：卵裂球大小不一致、胞质均匀，20%<细胞碎片≤40%，或卵裂球大小不一致，胞质不均匀，10%≤细胞碎片≤20%;ⅴ级：细胞碎片>40%;Ⅵ级：全碎片。D3有7～8个细胞数的Ⅰ、Ⅱ级胚胎为优质胚胎，其余D3胚胎为形态学低评分胚胎。
1.2.2 囊胚培养及评分
将低评分胚胎移至预先平衡好的G2培养液微滴中培养至5～7 d，观察胚胎发育情况，根据Gardner囊胚评分系统[5]对囊胚进行评分，将D5和D6评分≥3BB囊胚定为优质囊胚。
1.2.3 评价指标
主要观察指标：观察囊胚形成率及优质囊胚形成率。
1.3 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件包进行统计学分析，结果以百分率表示，率的比较采用χ2检验，显著性检验水准为α=0.05;组内两两比较按照χ2分割法，则分3组中的`两两比较的检验水平为0.0125。
2 结果
2.1 囊胚形成情况
本研究共收集422个取卵周期1 745个低评分胚胎进行囊胚培养，共形成囊胚1 046个，囊胚形成率为59.9%，其中优质囊胚为763个，优质囊胚形成率为43.7%。
2.2 年龄、基础窦卵泡数及基础卵泡刺激素(bFSH)与囊胚形成的关系
年龄≤35岁组的优质囊胚形成率高于年龄>35岁组，差异有统计学意义(P<0.01)，而2组的囊胚形成率差异无统计学意义(p>0.05)。患者基础窦卵泡数、bFSH各自组间的囊胚形成率及优质囊胚形成率差异均无统计学意义(P>0.05)。
2.3 促性腺激素(Gn)总剂量、人绒毛膜促性腺激素(hCG)日雌二醇(E2)水平、获卵数与囊胚形成的关系
随着Gn总剂量的增大，囊胚形成率及优质囊胚形成率逐渐降低，但组间囊胚形成率及优质囊胚形成率差异均无统计学意义(P>0.05)。根据hCG日E2水平将患者分3组，3组间的囊胚形成率及优质囊胚形成率差异均无统计学意义(P>0.05)。获卵11～20个组的囊胚形成率及优质囊胚形成率最高，获卵≤10个组的囊胚形成率及优质囊胚形成率最低，但各组间囊胚形成率及优质囊胚形成率差异均无统计学意义(P>0.05)。
2.4 D3卵裂细胞数、胚胎碎片与囊胚形成的关系
D3卵裂细胞球数为4～6个组的囊胚形成率及优质囊胚形成均最低，与卵裂细胞数为7～9个、10～14个组相比差异均有统计学意义(P<0.012 p="">0.012 5)。D3胚胎碎片≤10%组的囊胚形成率及优质囊胚形成率高于碎片为20%～25%组，≤10%组优质囊胚形成率高于10%<碎片<20%组，差异有统计学意义(P<0.012 p="">0.012 5)。
3 讨论
囊胚的形成受多种因素的影响，单独依据形态学评分来衡量囊胚的形成情况有一定局限性，所以在挑选低评分胚胎进行囊胚培养时，对囊胚形成的影响因素应该了解。探讨低评分胚胎囊胚形成的影响因素可为优质胚胎行囊胚培养提供一些理论依据及参考价值，从而提高囊胚形成率及质量，使更多的患者可选择单优质囊胚移植，提高妊娠率的同时又减少多胎率，且可利用低评分胚胎形成囊胚建立胚胎干细胞系用于科研，为胚胎干细胞提供更多的资源。另外低评分胚胎囊胚形成情况监测可作为实验室质量控制的一个常规项目，其对人类胚胎体外培养系统稳定性的衡量更为直接和准确。
3.1 年龄、基础窦卵泡数、bFSH与囊胚形成的关系
众所周知年龄、基础窦卵泡数、bFSH对卵巢储备功能的预测有重要意义，但有关年龄、基础窦卵泡数、bFSH对低评分胚胎囊胚形成的影响却鲜有报道。有研究发现，随女性年龄增大，胚胎染色体异常发生风险增高，特别是年龄>35岁时尤为明显[7]。另有研究显示，女性年龄的增长对囊胚扩张及孵化程度及滋养外胚层(TE)质量有负面影响[8]。本研究显示≤35岁组与>35岁组相比囊胚形成率差异无统计学意义，但优质囊胚形成率差异有统计学意义，提示年龄影响囊胚质量。本研究还显示基础窦卵泡数、bFSH对囊胚形成率及优质囊胚形成率没有明显影响，可能基础窦卵泡数及bFSH只与储备功能有关，影响获卵数及形成胚胎数，但不影响囊胚及优质囊胚形成率。
3.2 Gn总剂量、hCG日E2、获卵数与囊胚形成的关系
有研究显示温和的卵巢刺激可以减少早期卵裂的错误，可以得到更多的优质胚胎移植。同时有研究提示Gn总剂量水平与囊胚质量呈负相关。Thomas等研究显示优质囊胚的形成与Gn用量成反比，本研究结果与此结果相似，发现随着Gn用量的增加，囊胚形成率及优质囊胚形成率有降低趋势，但组间差异无统计学意义，可能是本研究中囊胚只来源于低评分胚胎及样本量不足的原因所致。Thomas等研究提示囊胚形成与促排卵第8天E2水平无关，与本研究结果相似。还有研究显示获卵数与TE质量呈负相关，但本研究结果提示囊胚形成率及优质囊胚形成率在获卵数≤10个、11～20个、>20个的组间差异均无统计学意义。
3.3 D3卵裂细胞数、胚胎碎片与囊胚形成的关系
大量的研究表明胚胎卵裂的快慢影响囊胚的形成。Wang等的研究显示7～9细胞组的胚胎囊胚形成率高于细胞≤6细胞组的囊胚形成率(P<0.05)，但与≥10细胞组的差异无统计学意义。温烯等的研究报道细胞数<8个时，随着细胞数增加，囊胚形成率有升高趋势，当细胞数>8个时囊胚形成率不再升高。但Racowsky等[13]发现卵裂速度较快及中等的胚胎其囊胚形成率显著高于卵裂速度缓慢的胚胎，且D3胚胎卵裂细胞数越多，胚胎发育速度越快，则其优质囊胚形成率就越高。本研究结果为临床囊胚培养提供参考：卵裂细胞数≥7个组的低评分胚胎囊胚形成率及优质囊胚形成率均高于卵裂细胞数为4～6个组，随着卵裂细胞数的增加，其囊胚形成率及优质囊胚形成率亦增加，但7～9个组与≥10个组相似。胚胎碎片会影响细胞之间的连接，干扰细胞的融合、囊腔和囊胚的形成;随着胚胎碎片的增多，囊胚形成率降低，囊胚的细胞数目尤其是TE数目减少。
本研究结果显示，碎片≤10%的胚胎优质囊胚形成率高于碎片>10%的胚胎，10%<碎片<20%的胚胎与20%～25%的胚胎囊胚形成率及优质囊胚形成率相似。
综上所述，低形态学评分胚胎有继续发育潜能及继续发育的能力。很少有文献涉及临床因素对低评分胚胎囊胚形成率的影响，本研究显示D3卵裂细胞数、D3胚胎碎片显著影响低评分胚胎的囊胚形成，其中年龄、D3卵裂细胞数、D3胚胎碎片影响低评分胚胎的优质囊胚形成。
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