Foxp3转录调控的探究论文
Foxp3，叉头/翼状螺旋转录因子3，是调节性T细胞关键性的转录因子，赋予调节性T细胞抑制功能。这个转录因子也通过与其他转录因子相互作用调节相关基因的表达，如NFAT(T细胞活化核因子)、NF-κB(核因子κB)、Runxl(runt相关转录因1)/AML1(急性白血病1)。尽管人们对于Foxp3进行了许多的研究，但是Foxp3是如何调节自身转录并未分析透彻。什么信号促使Foxp3自身转录，这是调节性T细胞在生物学领域的一个关键问题。最近的研究表明，通过T细胞受体(TCR)信号通路启动，白细胞介素2受体(IL-2R)信号转导和转录激活因子(STAT)途径、转化生长因子β(TGF-β)/Smad通路、Notch信号通路、干扰素(IFN)/干扰素调节因子(IRF)和IFN/一氧化氮(NO)轴以及磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)轴，均参与Foxp3转录调控。
1、Foxp3结构和功能
Foxp3是调控调节性T细胞(Treg)功能的关键性的转录因子，但其调控的分子机制仍待进一步阐明。Foxp3由一个氨基末端脯氨酸富集的区域(氨基酸1～193)和3个可辨别的功能结构域，羧基末端叉头域(氨基酸338～421)，一个单一的C2H2型锌指基序(氨基酸200-223)和一个亮氨酸拉链样基序(氨基酸240～261)组成。X染色体性联遗传症候群(IPEX)的患者，体内存在突变的Foxp3，这些患者表现出的症状与调节性T细胞缺陷疾病所表现的症状相一致。这一现象提示，突变的Foxp3可导致调节性T细胞功能的丧失。Foxp3结构中可能发生突变的区域已经被发现，包括上述除锌指基序以外的每个结构域。若其羧基末端叉头域发生突变，Foxp3与DNA结合能力减弱，而在亮氨酸拉链结构域的2个各自突变则会影响Foxp3同源和异源二聚体的形成。同时，关于Foxp1和Foxp2的相关研究也进一步证实亮氨酸拉链域的重要性，删除亮氨酸拉链域会丧失其作为转录抑制因子的能力。
能与Foxp3关联的蛋白复合物包括NFAT和NF-κB、磷酸化c-Jun、Runx1/AML1。NFAT和NF-κB能与Foxp3发生免疫共沉淀，且Foxp3和NFAT协同结合于IL-2启动子。经结构分析预测，Foxp3叉头域的残基直接与NFAT作用，当Foxp3残基发生诱变后，其抑制IL-2产生的能力降低。Lee等证实Foxp3可与磷酸化c-Jun相互作用，从而改变Foxp3的核定位和抑制转录因子活化蛋白-1(AP-1)的DNA 结合能力。除此以外，Foxp3 能够与Runx1/AML1 相互作用。RUNX家族成员(Runx1，2，3)对于造血发育至关重要，在CD4+T细胞中执行多种功能。Shameli等发现Foxp3和Runx1对IL-2启动子的作用方式与Foxp3-NFAT作用方式存在区别。Foxp3与Runx1相互作用位点并不在DNA结合域，而且启动子上每个转录因子结合位点之间均间隔一定的距离。
2、参与Foxp3转录的主要信号通路
2.1、IL-2R/STAT通路
IL-2在效应T细胞的分化和增殖中起重要作用，也是建立和维持免疫耐受的关键因子。根据目前的研究，IL-2R，而不是IL-2，是调节性T 细胞分化和Foxp3转录所必须的。IL-2R复合物的组分基因缺陷导致IL-2R信号传导途径的破坏，造成了严重的由T细胞介导的自身免疫，而不是免疫缺陷。IL-2-/-小鼠尽管易发生自身免疫，但Foxp3+ 调节性T细胞的数量相对正常。通过IL-2R/γ复杂的细胞因子信号通路，以促进调节性T细胞的分化。IL-2R下游信号可以通过Janus激酶(JAK)/STAT通路活化。STATs是拥有几个转录因子的超家族，可由多种细胞因子，激素和生长因子活化。STATs通过酪氨酸磷酸酶激活，主要由Janus激酶(JAK)导致STATs二聚化，核转移和参与靶基因转录调控。其中STAT5分子是IL-2信号通路的关键成分，它的不足使得天然的CD4+CD25+ Treg细胞数量减少从而导致自身免疫性疾病。Alahgholi-Hajibehzad等研究表明，IL-2在体外通过激活JAK1和JAK3，STATs发生磷酸化，尤其是STAT5，从而上调CD4+ T细胞Foxp3的转录。在此过程中，这些活化的转录因子移到核内，结合至高度保守的位于Foxp3基因启动子区或第一内含子的STAT结合基序，导致Foxp3的转录增加。IL-2R信号通路除了正调控Foxp3的转录水平以外，同时也可以负性调节Foxp3转录。蛋白酪氨酸磷酸酶使相关细胞因子如IFN-α的受体上的酪氨酸残基和活化的STATs去磷酸化。STATs蛋白抑制剂通过SH2结构域结合至IL-2受体或JAK的磷酸酪氨酸残基，发挥抑制作用。IL-2R触发也导致其他信号通路激活，包括PI3K/Akt/mTOR途径和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径。但是，有研究表明尽管调节性T细胞中具有明显的IL-2R信号图谱，但其下游调节者PI3K却没有被激活，而JAK/STAT依赖的信号仍然存在。这些说明了IL-2主要诱导JAK/STAT信号而非PI3K信号，这可能解释了IL-2对Treg和效应T细胞的一些不同功能。
2.2、TGF-β/SMAD通路
转化生长因子β(TGF-β)是参与调节细胞生长和分化的重要细胞因子。TGF-β1通过与丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合，诱导Smad2/3磷酸化，磷酸化的Smad2/3与Smad4形成蛋白复合物，随后转入细胞核内，通过招募共活化剂如CBP/p300，调节靶基因的转录。Smad7蛋白也参与靶基因的转录调节，但主要发挥抑制作用。大量的研究结果已表明：TGF-β在调节性T细胞分化和增殖过程中发挥着不可替代的作用。TGF-β对于维持外周淋巴组织中Treg的细胞数量是必不可少的，同时TGF-β能增强初始T细胞转化成Treg细胞的能力。作为TGF-β信号转导器，Smad蛋白，尤其是Smad3，能调节大部分TGF-β的活性。Anthoni等运用Smad3敲基因小鼠模型，研究Smad3在接触性超敏反应中的作用，发现由于Smad3-TGF-β信号缺失导致炎症的增加，Th2和Th17型免疫应答下调以及淋巴结中Foxp3的mRNA表达下降。Tone和同事研究发现Foxp3相对保守的增强子位点可与转录因子Smad3和NFAT结合，表明TGF-β是通过该位点来调节Foxp3的转录。而且Smad3和NFAT的结合，对诱导增强子区域组蛋白乙酰化和Foxp3转录是不可或缺的。但Smad3结合于增强子只发生在TGF-β依赖性诱导Foxp3表达的早期阶段，而在后期可能不发挥重要的作用，而NFAT与增强子结合在诱导Foxp3表达的整个期间均发挥关键性的作用。这些发现，从Foxp3的转录水平阐明了TGF-β对Foxp3+Treg细胞功能上的影响。
2.3、NOTCH1通路
Notch和其配体与T细胞成熟的调控和分化等多个过程有关。研究证实Notch信号参与调节性T细胞的分化和Foxp3转录。运用抗Notch1的配体(anti-Jagged1)或阻断性抗Notch1抗体来阻断Notch1信号，可体外抑制调节性T细胞的抑制功能。同时，Notch信号可以通过RBP-J(recombination signal sequence binding protein J)和HES1(hairy and enhancer of split-1)依赖机制调节Foxp3启动。在调节性T细胞中，Notch胞内段(NICD)转入细胞核，与Foxp3结合并反式激活RBP-J。RBP-J识别一段保守DNA序列，其存在于多个下游基因包括HES家庭成员HES1。研究者认为Notch信号可以双向调节Foxp3启动子：在低浓度Notch信号通过NICD-RBP-J复合物激活Foxp3的启动子，而在高浓度，它通过HES1抑制Foxp3启动子。
Notch信号通路的信号模式和TGF-β信号通路有相似之处，他们均通过NICD和Smad3蛋白相互作用来实现对靶基因的调控。过表达NICD便于pSmad3易位至细胞核，并且由于Treg细胞对Smad蛋白敏感而增强启动子上pSmad3转录活性。γ-分泌酶(GSI)通过抑制Notch信号通路，从而阻断由TGF-β1诱导的Foxp3转录和表达。此外，GSI还可以抑制NICD，核转录因子CSL和Smad结合于Foxp3的启动子保守的结合位点。另外，体内实验也证实GSI可以通过抑制Foxp3转录水平，引起与TGF-β的信号传导和Treg调节功能异常所导致的自身免疫性肝炎一致的症状。这些实验数据表明Notch1信号能促进TGF-β介导的Treg抑制功能和Foxp3转录。总之，Notch和TGF-β的信号通路共同调节在体内外Foxp3转录，并且参与维持Treg功能。
2.4、IFN/IRF及IFN/NO
IFN-γ是一个标志性的促炎细胞因子，启动干扰素调节基因，包括干扰素调节因子1(IRF1)的转录，在炎症和自身免疫疾病中起重要作用。IRF1是一种涉及各种免疫调节过程的多效转录因子，IRF1是CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞Foxp3转录的直接负调节者。通过特异性抑制Foxp3的转录和表达，IRF1负性调控CD4+CD25+Treg细胞的发育和功能。IRF1-/-小鼠的胸腺和所有外周淋巴器官，其高度分化CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞显著增加。此外，IRF1-/-来源的`CD4+CD25-T细胞易分化成CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞，而IRF1-/-来源的CD4+CD25- T 细胞，若恢复其IRF1的表达，则分化为CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的能力受损。在功能上，与野生型Treg细胞相比，从IRF1-/-小鼠分离的和TGF-β诱导的CD4+CD25+Treg细胞都表现出更强的抑制活性。IRF1结合于体内Foxp3基因启动子一个高度保守的IRF共识元件序列，并负性调控其转录活性。IRF4是干扰素调节因子中另一家庭成员，IRF-4与NFATc2(Nuclear factorof activated T-cells cytoplasmic 2)协同作用，加强NFATc2驱使的IL-4启动子转录激活，从而抑制Foxp3的转录。NO是一个多种生物功能的关键调节者，同时参与一些重要的免疫病理反应。NO由胍基氮原子和分子氧由一氧化氮合酶(NOS)催化而来。IFN-γ是NOS活性的有效诱导剂。实验表明，STAT1磷酸化可以导致NOS转录。值得注意的是，在缺乏IFN-γ的情况下，通过抑制NOS可阻止Foxp3的转录和NO合成，证实了IFN-γ-STAT1-NO在Foxp3的转录中的重要作用。Farrow等发现NO可以诱导CD4+CD25-T细胞转化为CD4+CD25+ Foxp3-Tregs细胞。也有证据表明IFN-γ通过抑制IL-4从而上调Foxp3的表达。IFN-γ作为免疫应答和炎症的主要调节者，具有双向免疫调节的功能。
2.5、PI3K/Akt/mTOR
PI3K和蛋白激酶B(PKB或Akt)信号轴在细胞增殖和生长信号中起重要作用。对于免疫系统，大量数据阐明此信号通路在淋巴细胞发育中的作用。PI3K/Akt通路是由TCR复合物(TCR/CD3)介导的T细胞活化所必需的。通过免疫受体中基于酪氨酸活化的基序中的CD3胞质尾，TCR/CD3复合物刺激信号进行转导。许多证据表明PI3K/Akt/mTOR信号网络参与调节性T 细胞分化和功能：在P110δ(PI3K的催化亚基)缺陷的小鼠胸腺中，调节性T细胞数量增加;雷帕霉素可以促进在特定环境中Treg细胞的分化，Akt等位基因持续活化以激酶依赖方式和通过雷帕霉素敏感通路大大减少由TGF-β诱导的Foxp3转录和表达。Sauer等所提供的遗传学和药理学数据表明，TCR信号的终止和PI3K的P110α，P110δ/Akt/mTOR的抑制，促进Foxp3的表达。相反，持续的TCR信号和PI3K/AKT/mTOR活化，阻止Foxp3的诱导。在染色质水平，二-和三-甲基化的组蛋白H3K4位于Foxp3的转录起始位点附近，5'端非编码区激活Foxp3的转录，诱导Foxp3表达。这些数据证实，TCR/PI3K/Akt/mTOR信号参与Foxp3的转录调控。在TGF-β刺激下，能检测到pSmad2(S465/467)的表达，但在TCR 信号剥夺或PI3K 和mTOR的抑制时则无表达。运用中和TGF-β的抗体和Smad激酶抑制剂，阻断由TGF-β诱导的Foxp3的表达，但并没有影响由PI3K/mTOR 抑制剂诱导的Foxp3 表达。因此，即使TGF-β是Foxp3转录的一个功能强大的诱导剂并且与PI3K/mTOR的抑制剂发挥协同作用，但目前没有任何证据表明，PI3K/mTOR的Foxp3转录调节系统中TGF-β是必不可少的。PI3K/Akt/mTOR信号通路的抑制代表了对自身免疫性疾病另一种有效的治疗策略。
3、结语
Foxp3作为调节性T细胞的分化、增殖和功能的调节者，其转录的抑制/促进因子，在自身免疫疾病和肿瘤发生、发展过程中发挥着重要的作用。在转录水平，Foxp3与NFAT、AML1等其他因子相互作用结合于Treg细胞重要基因的启动子区域，以上调或下调重要分子(表面标志、细胞因子)的表达。另外，Foxp3本身的表达水平受外界因素的影响，如TCR的活化信号、重要细胞因子(IL-2，TGF-β，IFN-γ等)的表达水平、重要转录因子(NFAT，Smad，STAT，PI3K，Akt)通过相互作用调节Foxp3基因调控元件。
总之，研究有关Foxp3的上游信号分子，通过调节Foxp3+Treg细胞，将有助于对自身免疫性疾病，炎性疾病，移植排斥，感染和肿瘤发病机制的进一步认识。
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